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实时荧光定量PCR是分子生物学的核心检测技术，通过在PCR扩增中引入荧光标记，实现对目标核酸的精确定量。其“实时”特性指在DNA扩增过程中同步监测荧光信号的变化，而“定量”则可准确测定目标基因的拷贝数。该技术从传统PCR发展而来，引入荧光检测后，完成了从定性到定量的突破。
在分子诊断领域，实时荧光定量PCR已成为病原体检测和基因表达分析的金标准，相比传统终点PCR，具有避免污染、动态范围广、灵敏度高的优势。实时荧光定量PCR由美国应用生物系统公司（ABI）于1996年推出，随后在全球广泛应用。疫情期间，它作为关键检测手段助力全球抗疫，也让公众对其有了更深入的了解。
一、实时荧光定量PCR的检测原理是什么？
实时荧光定量PCR技术建立在PCR（聚合酶链式反应）的基础上，在反应过程中，目标DNA片段会经历变性（95℃）、退火（60℃左右）和延伸（72℃）3个阶段。每经过1个循环，目标片段的数量就会翻倍。通过在反应体系中加入能与DNA结合的荧光探针或染料，随着目标DNA的扩增，荧光信号也会同步增强。
仪器通过记录每个循环的荧光强度，就能计算出起始样本中的DNA含量。这个过程通常需要进行35—45个循环。扩增效率在理想条件下接近100%，即每个循环DNA数量翻倍。仪器通过检测每个循环的荧光值，绘制扩增曲线，根据阈值线与扩增曲线的交点确定Ct值（阈值循环数）。实时荧光PCR反应的核心是指数扩增原理，理论上每一个循环中目标DNA片段数量都会翻倍。
实际操作中，前期循环反应效率最高，呈现指数增长；中期循环保持线性增长；后期由于反应物耗尽，进入平台期。正是这种精确的数学模型，使得从荧光信号到DNA定量的转换成为可能。在临床应用中，通常采用Ct值40为阳性判断标准，这一数值的确定基于大量实验数据和临床验证。
二、荧光检测系统有哪些类型？
荧光检测系统主要分为两大类：探针法和染料法。探针法使用带有荧光基团的特异性探针（如TaqMan探针），只有当探针与目标序列完全匹配时才会发出荧光，特异性很高。染料法虽然特异性较差，但通过溶解曲线分析可以部分弥补这一缺陷。染料法则使用能与双链DNA结合的荧光染料（如SYBR Green），操作简单但特异性较差。选择哪种方法，要根据具体实验需求来确定。
除了上述两种主流荧光检测系统外，还有多种特殊类型的检测方法不断涌现。分子信标（Molecular Beacon）探针利用发夹结构设计，在未结合靶序列时自我淬灭，结合后打开发夹结构发出荧光。双标记探针（Double-labeled Probes）在两端分别标记荧光基团和淬灭基团，当探针被DNA聚合酶降解时释放荧光。
三、定量分析是如何成功实现的？
实时荧光定量PCR有两种定量方式：绝对定量和相对定量。绝对定量需要建立标准曲线，通过一系列已知浓度的标准品，确定未知样本中的核酸拷贝数。相对定量则是通过比较目标基因与内参基因的表达比值，计算不同样本间基因表达量的相对变化。在临床病毒检测中多用绝对定量，而基因表达研究则常用相对定量。
四、实时荧光定量PCR技术的操作流程是怎样的？
实验室在收到样本后，先提取核酸，这是检测的基础。核酸提取完成后，加入特定的引物探针和其他反应试剂，确保反应体系配制准确。将反应混合液加入反应板中，放入实时荧光PCR仪器进行扩增检测。整个过程在2—4小时内完成，最后由计算机分析数据生成报告。
五、实时荧光定量PCR技术在生活中最为常见的应用是什么？
疫情期间的核酸检测让大众深入了解实时荧光定量PCR技术，其在医疗领域的广泛应用。核酸检测可用于检测流感、肝炎等传染病病毒，助力快速确诊；在肿瘤诊疗中，可监测癌症标志物，评估治疗效果和预后；在临床用药时，通过基因检测为医生提供精准治疗方案，提升疗效；在孕期检查中，可早期发现胎儿遗传疾病的风险；在传染病诊断中，不仅能定性检测，还能通过病毒载量评估治疗效果；在肿瘤诊断中，可检测基因突变或表达水平变化；在药物基因组学研究中，可用于预测药物反应并指导个体化治疗。
六、如何确保检测结果的准确性？
检测的准确性首先取决于规范的操作流程。采样人员必须经过专业培训，掌握正确的取样方法和防护要求。样本运输要保证冷链，送检时间要严格控制在有效期内。
实验室操作必须在生物安全柜中进行，试剂要定期进行效果验证。每次检测都要设置质控品，包括阳性对照、阴性对照和内参基因对照。
当发现任何异常情况，如质控结果不合格，必须立即停止检测并查找原因。实验室要定期参加室间质评，通过外部评价来验证检测的可靠性。
七、检测报告上的数据代表什么？
以新冠核酸检测为例，一份标准的检测报告包含几个关键信息。最基本的是定性结果，也就是“阴性”或“阳性”的判断，这直接告诉我们体内是否存在病毒。报告中的Ct值反映了病毒的多少，这个数值越小，说明体内的病毒数量越多。
ORF1ab和N是新冠病毒特有的基因片段，检测这些片段能够准确识别是否感染了新冠病毒。报告中还会包含内参基因的检测结果，这是用来确认样本质量是否合格的重要指标，确保整个检测过程的可靠性。
（广西壮族自治区玉林市第二人民医院 张丽）
